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长麦穗鱼(Pseudorasbora elongata)附庸于鲤形目(Cypriniformes)、鲤科(Cyprinidae)、鮈亚科(Gobioninae)、麦穗鱼属，是我国稀奇的袖珍鱼类。与其同属的麦穗鱼比拟，长麦穗鱼的散播领域极为褊狭，仅散播于长江中卑劣水系的建德、石台和祁门，以及西江水系的阳朔和桂林[1-4]。长麦穗鱼对生境条目严苛，偏好清楚的缓流浅滩和卵砾石底质生境。受栖息地环境改变、过度捕捞等东说念主类活动的影响，长麦穗鱼野生资源量接续下落、散播区域温存萎缩等问题变得尤为凸起，已被《中国濒危动物红皮书：鱼类》和《中国物种红色名录(第一卷)》列为“易危”种[5-6]。凭据前期的访问后果及历史研究贵寓发现，在长麦穗鱼的历史散播区建德，现已不见陈迹，而漓江散播区在20世纪就已面对绝迹[7-8]。当今，长麦穗鱼仅在安徽境内长江流域的石台和祁门地区偶有发现。因此，对安徽长江流域现有长麦穗鱼种质资源张开访问婷儿 勾引，分析并厘清其遗传千般性和遗传结构近况，评估其历史动态，对长麦穗鱼种质资源的保护及后续的可握续发展极为紧迫。

遗传千般性是物种生计(顺应)和发展(进化)的前提，可反馈出其进化历史及进化后劲。鱼类同其他脊椎动物相似，其线粒体DNA (mitochondrial DNA， mtDNA)呈闭合环状，具有母系遗传、结构简单、进化速度快等特色，是一种紧迫的分子记号[9]。mtDNA中细胞色素b (cytochrome b， Cyt b)是研究得最为清晰的卵白质编码基因之一，其进化速度适中；而mtDNA适度区(control region displacement loop， D-loop，又称D-环区)不参与编码卵白质，进化速度快，且与Cyt b基因在进化上存在各别[10-11]。因此，mtDNA Cyt b基因和D-loop区常行为分子记号被平时应用于鱼类的遗传千般性研究[12-15]。当今，已有学者对长麦穗鱼的mtDNA序列及结构作念了面目，但对其种群遗传结构及千般性未见系统报说念[16]。研究发现，长麦穗鱼在形态学上与扁吻鮈属的鱼类有诸多相似特征，而在对麦穗鱼属系统发育关连的研究中发现，长麦穗鱼是源头分化出来的一支，与本属其他种亲缘关连相对较远[17]。据此，本研究拟秉承长麦穗鱼mtDNA Cyt b基因及D-loop区序列对安徽皖南山区长麦穗鱼种群遗传千般性近况和遗传结构进行分析和评估，以期为后续长麦穗鱼的系统进化、种质资源的任意及开导利用与可握续发展提供表面依据。

1　材料与方法 1.1　样品采集与DNA索求

长麦穗鱼样品于2018年4月至2019年12月用地笼网网罗于长江中卑劣安徽境内皖南山区的闪里(SL)、历口(LK)和石台(ST) 3地(图1)，所有这个词141尾，取鳍条组织置于无水酒精中保存。长麦穗鱼基因组DNA依据天根生化科技(北京)有限公司动物组织基因组DNA索求试剂盒(DP304-02)进行索求，基因组DNA经1%的琼脂糖凝胶电泳检测后，保存于−20 ℃雪柜备用。

图1 　长麦穗鱼采样点散播图 Fig. 1 　Sampling sites of Pseudorasbora elongata 1.2　PCR扩增与测序

凭据NCBI数据库中长麦穗鱼mtDNA全序列(GenBank: KF051938)，利用Primer Premier 5.0盘算引物用于Cyt b基因和D-loop区序列扩增。本研究所用扩增和测序的引物序列为，Cyt b F: 5ʹ-ATGGCAAGCCTACGAAAAACCC-3ʹ、Cyt b R: 5ʹ-AGGGCAAGCTCATTTTAGTGCTT-3ʹ; D-loop F: 5ʹ-TTAACTCCCACCCCTGGCTC-3ʹ、D-loop R: 5ʹ-CGGAGCTTTCTAGGGCCCAT-3ʹ。PCR反应体系25 μL，包含10×PCR Buffer 2.5 μL， MgCl2 2 μL， dNTP 0.5 μL， DNA模板1 μL，上、卑劣引物各0.5 μL， Taq DNA团员酶0.5 μL， ddH2O补足体积。扩增样式：预变性94 ℃ 3 min；变性94 ℃ 30 s， 52 ℃ (Cyt b)或54 ℃ (D-loop)退火30 s， 72 ℃蔓延1 min; 35个轮回，72 ℃蔓延10 min。扩增家具经由1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后，送样测序。本研究引物合成及扩增家具测序均由北京擎科生物有限公司武汉分公司完成。为保证测序准确性，扫数样品均秉承双向测序。

1.3　数据分析

所得到测序后果诈欺Vector NTI软件进行拼接，序列整理后在GenBank中进行比对，证据扩增片断即为本研究方针片断。利用Clustal X2软件对测序后果进行比对，去除两头冗余序列。诈欺DnaSP 5.0软件得到基于Cyt b和D-loop序列的单倍型数(number of haplotypes， h)、单倍型千般性指数(haplotypes diversity， Hd)、核苷酸千般性指数(nucleotide diversity， π)、平均核苷酸各别指数(average number of nucleotide differences， K)以及多态位点数(number of polymorphic sites， S)[18]。使用MEGA X软件筹画Cyt b基因和D-loop区序列的碱基组成、变异及保守位点、转换与颠换比值，秉承最大似然法(maximum likelihood， ML)构建系统发育进化树，各分支置信度用Bootstrap重迭检测1000次[19]。诈欺Arlequin3.5软件筹画遗传分化指数(F-statistics， Fst)和分子变异分析(analysis of molecular variance， AMOVA)，基因流(Nm)由公式Nm≈(1−Fst)/4Fst筹画[20-21]。诈欺中介法(median joining， MJ)构建单倍型汇集结构图(Network 5.0)。

2　后果与分析 2.1　长麦穗鱼线粒体Cyt b基因和D-loop区的序列特征

测序后果经由翻新比对后，分别得到长麦穗鱼Cyt b基因序列1046~1049 bp和D-loop序列938~941 bp。通过MEGA X软件筹画序列碱基组成，后果流露皖南山区3个长麦穗鱼群体间Cyt b和D-loop序列4种碱基A、T、G、C的平均含量分别为28.5%、32.3%、13.8%、25.4%和33.9%、34.0%、12.9%、19.2% (表1)，两序列均出现彰着AT偏移，A+T (60.8%、67.9%)高于G+C (39.2%、32.1%)，允洽已知鱼类线粒体DNA序列特征。此外，Cyt b基因4种碱基在第1、2和3位密码子散播也出现偏倚性，碱基A偏向第1位密码子(34.7%)，碱基T偏向于第3位密码子(38.8%)。Cyt b基因序列有3个碱基插入或缺失，包含50个变异位点，其中单元点突变11个，从简信息位点39个；变异位点的转换/颠换比为1.89，转换以碱基C/T间为主。D-loop区序列有5个碱基插入或缺失，包含变异位点43个，包括从简信息位点37个和单突变位点6个，变异位点的转换和颠换比值为1.43。

表1 　长麦穗鱼线粒体Cyt b基因和D-loop区序列的碱基组成 Tab. 1 　Nucleotide composition of mtDNA Cyt b gene and D-loop region sequences of Pseudorasbora elongata 2.2　群体遗传千般性分析

使用DNAsp5对皖南山区3个地舆群体长麦穗鱼的遗传千般性参数进行分析统计，后果如表2所示。Cyt b基因在长麦穗鱼3个群体的137个个体中共检测到18种单倍型，3个群体的单倍型千般性指数(Hd)为0.275~0.721，长麦穗鱼合座Hd为0.792; 3个群体的核苷酸千般性指数(π)为0.00038~0.00172婷儿 勾引，合座为0.01332，核苷酸千般性较高。核苷酸各别数(K)在3个群体中的各别与核苷酸千般性一致。D-loop区序列在3个群体141个个体中共检测到27种单倍型，单倍型千般性指数为0.053~0.773，合座Hd为0.777；核苷酸千般性指数0.00017~0.0026，合座π为0.01140; 3个群体合座核苷酸各别数K为10.623。其中，长麦穗鱼ST群体Cyt b基因和D-loop区序列的Hd和π分别为0.275和0.00038、0.053和0.00017，均是3个群体中最低的。

2.3　群体间的遗传距离和遗传分化分析

基于K2P模子筹画皖南山区长麦穗鱼群体内和群体间遗传距离(表3)。长麦穗鱼Cyt b基因的分析后果流露，3个群体内的遗传距离为0.00038~ 0.00172，群体间的遗传距离为0.00173~0.03615；其中，ST群体内的遗传距离最小(0.00038); ST和LK间的遗传距离最大(0.03615); SL和LK间的遗传距离最小(0.00173)。基于D-loop区序列的筹画后果标明，ST群体内的遗传距离最小(0.00011)， SL和ST群体间的遗传距离最大(0.02639)。

表2 　基于线粒体Cyt b基因和D-loop区序列的长麦穗鱼群体的遗传千般性参数和中性历练 Tab. 2 　Genetic diversity and neutral test of Pseudorasbora elongata based on the sequences of mtDNA Cyt b gene and D-loop region 表3 　基于线粒体Cyt b基因和D-loop区序列的长麦穗鱼群体遗传距离 Tab. 3 　Genetic distance within/among Pseudorasbora elongata populations based on the sequences of mtDNA Cyt b gene and D-loop region

长麦穗鱼3个群体间遗传分化指数和基因流分析后果流露(表4)，基于Cyt b基因和D-loop区序列长麦穗鱼群体间的固定指数Fst为0.10688~ 0.97247、0.05332~0.98421，并据此筹画长麦穗鱼群体间的基因流Nm分别为0.00707~2.08907、0.00401~4.43867，标明3个长麦穗鱼群体间存在不同进程的遗传分化，且珍爱基因相易。相较而言，SL和LK群体间分化进程较低，ST和SL及LK群体间的遗传分化进程均较高。

表4 　基于线粒体Cyt b基因和D-loop区序列的长麦穗鱼群体间固定指数和基因流分析 Tab. 4 　Pairwise fixation indices and gene flow among Pseudorasbora elongata populations based on mtDNA Cyt b gene and D-loop region

长麦穗鱼群体间的分子方差分析(AMOVA)后果如表5所示，基于Cyt b基因和D-loop区序列，长麦穗鱼群体间的遗传变异分别占94.60%、90.69%，群体内的遗传变异占5.40%、9.31%，流表示长麦穗鱼群体间的遗传变异远高于群体内，标明长麦穗鱼的遗传变异主要来自于群体间。

2.4　单倍型散播与系统进化分析

经ClustalX软件比对，基于Cyt b基因和D-loop区序列诈欺DnaSP软件分别界说了18和27种单倍型。在Cyt b基因的单倍型中，Hap2是上风单倍型，占比高达37.2%，为SL和LK群体所共有；Hap1、Hap4、Hap7、Hap10、Hap11是SL群体稀奇的单倍型；Hap6、Hap8、Hap9、Hap12、Hap13为LK群体所独享；值得扫视的是ST群体的5种单倍型均为该群体所稀奇，且Hap14是ST群体的上风单倍型(表6)。在D-loop区序列界说的单倍型中，Hap1是上风单倍型，为SL和LK群体共有；值得扫视的是SL群体独享的单倍型种数高达23种，而ST群体仅有Hap26和Hap27两种单倍型，均为该群体所稀奇，且Hap26是ST群体的上风单倍型(表6)。以同属的麦穗鱼(Pseudorasbora parva，基因登录号：JF802126.1)及扁吻鮈属的扁吻鮈(Pungtungia herzi，基因登录号：AB239598.1)为外群，基于长麦穗鱼Cyt b基因界说的18种单倍型和D-loop区序列界说的27种单倍型，分别构建ML系统进化树(图2a、2b)。由系统进化树可知，基于Cyt b基因(图2a)和D-loop区(图2b)序列构建的两个长麦穗鱼系统发育树均可彰着地分为2个分支：一个分支由ST群体的单倍型组成；另一个分支由SL和LK群体的单倍型组成。这与上述ST和SL、LK群体间的遗传距离相对较远，群体间的遗传分化指数较高相符。另外，值得扫视的是，系统进化流表示长麦穗鱼与扁吻鮈聚在一说念，而不是同属的麦穗鱼，标明其与扁吻鮈的亲缘关连更近。

表5 　长麦穗鱼群体遗传各别的分子方差分析(AMOVA) Tab. 5 　Analysis of molecular variance (AMOVA) of Pseudorasbora elongata 表6 　基于线粒体Cyt b基因和D-loop区序列的长麦穗鱼3个群体的单倍型散播 Tab. 6 　Haplotype distribution in three Pseudorasbora elongata populations based on mtDNA Cyt b gene and D-loop region

基于中介法(medium-join， MJ)，诈欺Network5.0软件构建长麦穗鱼Cyt b基因和D-loop区单倍型汇集结构图。基于Cyt b基因18种单倍型构建的网格图如图3a所示，Hap2和Hap3单倍型较为陈腐，位于网格图中心位置，因3个节点而繁衍出来的单倍型呈辐散状散播于其周围；ST群体的上风单倍型Hap14由SL群体Hap1繁衍而来。基于D-loop序列27种单倍型构建的网格图如图3b，网格图合座以Hap1单倍型为中心，各群体的单倍型皆获胜或盘曲由Hap1突变后形成，呈辐散状散播于其周围。总体来看，长麦穗鱼单倍型网格图呈现的地舆散播花式与系统进化树后果访佛。

图2 　基于线粒体Cyt b基因(a)和D-loop区(b)序列的长麦穗鱼单倍型系统进化树 Fig. 2 　The phylogenetic tree based on haplotypes of Cyt b gene (a) and D-loop region (b) in Pseudorasbora elongata 图3 　基于长麦穗鱼线粒体Cyt b基因(a)和D-loop区(b)单倍型的汇集结构图 Fig. 3 　The haplotype network based on Cyt b gene (a) and D-loop region (b) in Pseudorasbora elongata 2.5　种群历史动态

将皖南山区长麦穗鱼3个群体行为合座基于Cyt b基因和D-loop区序列进行中性历练，后果流露Tajima’D值和Fu’s Fs值均为正好(表2)，且核苷酸错配散播散播图为多峰(图4d、4h)，标明皖南山区长麦穗鱼允洽中性进化假定，历史上未发生过种群蔓延。基于Cyt b基因3个群体的Tajima’D值和Fu’s Fs值均为负值，且关于ST群体来说Tajima’D值(P<0.01)和Fu’s Fs值(P<0.05)统计学分析存在各别，偏离中性历练模子，其核苷酸错配散播图呈现单峰(图4c)，标明ST群体在历史上发生过种群蔓延；SL和 LK群体核苷酸不配对图呈现多峰(图4a、4b)，评释其未发生蔓延。基于D-loop区序列，ST群体Tajima’D值和Fu’s Fs值均为负值，且Tajima’D值统计分析中存在权贵各别(P<0.05)，其核苷酸不配对图呈单峰，也评释其历史上发生过蔓延(图4g)。而LK群体Tajima’D值和Fu’s Fs值为正好，SL群体Tajima’D值和Fu’s Fs值为负值，但Tajima’D值不存在权贵性各别(P>0.05)，二者核苷酸错配散播图均呈现多峰(图4e， 4f)，评释历史上未发生群体蔓延事件。

图4 　基于线粒体Cyt b基因和D-loop区序列的长麦穗鱼核苷酸错配散播图a. 闪里，b. 历口，c. 石台，d. 合座（Cyt b）; e. 闪里，f. 历口，g. 石台，h. 合座（D-loop）. Fig. 4 　Mismatch distribution of Pseudorasbora elongata based on mtDNA Cyt b gene and D-loop region sequencesa. SL， b. LK， c. ST， d. Overall (Cyt b); e. SL， f. LK， g. ST， h. Overall (D-loop). 3　议论

研究种群的遗传千般性可揭示其发祥与进化历史，亦可反馈出其进化后劲。遗传千般性研究是评价种群资源景象以及开展保护责任的紧迫基础与依据，高水平的遗传千般反馈出种群对环境有较强的顺应智商，受环境压力影响小，该种群越容易延续；相背，遗传千般性水平过低则可能导致种群遭受瓶颈以致腐烂[22-23]。

3.1　长麦穗鱼种群遗传千般性

本研究以mtDNA的Cyt b基因和D-loop区为记号对3个长麦穗鱼群体遗传千般性近况张开了访问和研究。通过PCR得到SL、LK、ST 3个长麦穗鱼群体线粒体Cyt b基因和D-loop区同源片断序列，分析流露序列碱基含量A+T均高于G+C，出现彰着的AT偏倚与反G的偏歧征象，这与已知包括鱼类在内的动物线粒体基因组核苷酸散播不均一情况相一致[12-15，23]。D-loop区序列不编码卵白质，且在mtDNA中进化速度最高，变异通过母系遗传而保留，以此为遗传标牢记到的单倍型数不时更多。在本研究中，D-loop区序列界说了27个单倍型，高于Cyt b基因记号界说的单倍型数(18个)。单倍型千般性指数(Hd)和核苷酸千般性指数(π)是常用来评估物种遗传千般性高下的方针。凭据Grant[24]和Bowen等[25]建议来的分类轮番(Hd=0.5、π=0.005)，将遗传千般性分袂为4种模式。本研究中，长麦穗鱼合座的Hd为0.792 (Cyt b)、0.777 (D-loop)， π为0.01332 (Cyt b)、0.01140 (D-loop)允洽上述高单倍型千般性和低核苷酸千般性的模式。由于核苷酸千般性的齐集比单倍型更漫长，预计允洽该遗传千般性模式的种群可能履历了瓶颈效应或建群效应后蔓延，同期又无填塞时辰去齐集核苷酸变异[24-25]。ST群体长麦穗鱼Hd为0.275 (Cyt b)、0.053 (D-loop)， π为0.00038 (Cyt b)、0.00017 (D-loop)，均远低于上述分袂轮番。这一后果标明ST群体遗传千般性处于较低水平，该群体极有可能遭受过瓶颈效应，亦或是基础群体较小，遗传千般性仅有单一或少量数群体形成，这也反馈出ST群体资源量严重枯竭的近况。此外，本研究发现基于D-loop区序列得到的遗传变异数及遗传千般性指数均低于Cyt b基因的后果。一般情况下，D-loop区进化速度快，得到的种群的遗传变异频繁大于Cyt b基因，但赵亮等[26]的研究种也发现的mtDNA适度区的变异速度低于Cyt b基因。综上，关于长麦穗鱼遗传千般性近况应加强其保护力度，服从加多其资源量，以提升其遗传千般性水平，幸免长麦穗鱼种质资源进一步阑珊。

3.2　长麦穗鱼种群的遗传结构与遗传分化

不同物种间或同种不同种群间的遗传各别进程频繁用遗传距离来计议。本研究中3个长麦穗鱼群体间的遗传距离为0.00173~0.03615 (Cyt b)、0.00193~0.02639 (D-loop)，相较而言，SL和LK群体间的遗传距离较小，ST群体与SL及LK间的遗传距离均较大，这与其地舆散播花式相一致。基于Shaklee等[27]建议的鱼类在属(0.9)、种(0.3)、种群(0.05)三级水平上的分袂依据，本研究3个长麦穗鱼群体未达到种群分袂轮番(群体间的遗传距离均小于0.05)，评释3个群体可能由统一祖宗种群扩散形成。鱼类因地舆阻挠或在统一水域中栖息环境不同而适度种群的基因相易，这是种群分化的紧迫原因，并由此呈现出与其散播水系相吻合的遗传分化花式[28]。遗传分化指数Fst是评估遗传分化进程的紧迫方针，在内容研究中，凭据Wright的分类轮番：当0<Fst<0.05时，标明群体间遗传各别很小；0.05<Fst<0.15，标明群体间遗传分化达到中等进程水平；0.15<Fst<0.25，标明存在较大的遗传分化；Fst>0.25，则遗传分化很大[28-29]。本研究中SL和LK群体间Fst为0.10688 (Cyt b)、0.05332 (D-loop)，处于中等进程的遗传分化；而ST和LK及ST和LK群体间的Fst值均大于0.9，标明该群体间呈现高度遗传分化花式。此外，基因流亦然评估种群遗传结构和遗传分化的紧迫方针，本研究中SL和LK群体间的基因流Nm值大于1；而ST和SL及ST和LK群体间的Nm值均远远小于1。研究以为，Nm<1则标明群体间遗传分化较大；Nm>1标明群体间地舆距离很近或有某种渠说念不错进行基因相易，群体间的遗传分化较小；Nm>4则评释群体间个体不错当场交配[30-31]。分子方差分析AMOVA后果流露长麦穗鱼群体间的遗传变异高达90%以上，评释群体间的变异是长麦穗鱼遗传变异的主要起首。综上，变成3个长麦穗鱼群体呈现上述遗传分化花式的原因与其散播的水系密切经营，SL和LK群体同属于阊江上游支流，有基因相易的契机；而ST群体散播于秋浦河，由于水系的阻挠适度了ST群体与其他两个群体间的基因相易，从而与其他群体间发生了彰着的遗传分化。

基于Cyt b基因和D-loop区序列界说的单倍型构建了ML系统进化树。从系统进化角度来看，3个长麦穗鱼群体形成了两个彰着的地舆聚群：一支由SL和LK群体单倍型组成且这两个群体单倍型相互搀杂未形成彰着的系统进化关连；另一支由ST群体的单倍型组成且与其他2个群体不分享，标明ST群体与SL和LK群体珍爱基因相易，形成了彰着的地舆遗传结构，这与上述遗传分化花式后果相一致。此外，单倍型Hap2 (Cyt b)、Hap1 (D-loop)均为SL和LK群体的上风单倍型且在汇集结构图中处于中心位置，汇集结构图呈现出的单倍型地舆散播花式与ML系统进化树后果一致。本研究中，值得扫视的是本研究系统进化标明长麦穗鱼和同属的麦穗鱼亲缘关连较远，反而与扁吻鮈属的扁吻鮈亲缘关连更近(图2)。长麦穗鱼在形态上与扁吻鮈有相似特征，如二者体型均近似圆筒状，而同属的麦穗鱼体型侧扁；长麦穗鱼和扁吻鮈体侧自吻端沿侧线至尾鳍有玄色纵纹，而麦穗鱼则无此特征[1]。因此，建议后续对长麦穗鱼的系统进化可作念进一步深远研究。

3.3　长麦穗鱼种群的历史动态与保护

利用核苷酸错配散播图与中性历练预计种群是否履历过蔓延事件。若Tajima’D和Fu’s Fs呈现负值，且具备统计学真谛，则标明该种群权贵偏离中性历练模子，反馈出种群历史上可能履历过蔓延事件[32]。此外，若核苷酸错配散播图呈现泊松散播的单峰，则标明种群可能履历了种群蔓延事件[33]。本研究中核苷酸错配散播图及中性历练后果标明长麦穗鱼合座历史上近期未发生过彰着的群体蔓延。但ST群体的核苷酸错配散播图呈现单峰，Tajima’D和Fu’s Fs历练存在权贵性各别，偏离中性进化假定，评释ST群体历史上可能履历过种群蔓延事件大约近期遭受了瓶颈效应。

研究鱼类的遗传千般性近况、遗传结构与谱系地舆花式可为鱼类保护计策及渔业不竭措施的制定提供参考。长麦穗鱼是我国稀奇的袖珍鱼类，比年来受环境变化及东说念主为成分的影响，其野生资源量接续下落。本研究发现长江中卑劣安徽境内长麦穗鱼遗传千般性总体较为丰富婷儿 勾引，但各群体内的遗传千般性相对较为缺少，3个群体呈现出2个主要的谱系关连。其中，ST群体的遗传千般性最低，且其遗传距离、遗传分化指数等均与其他两个群体存在一定进程的阻挠。凭据进化权贵单元(evolutionarily significant unit， ESU)缔造的原则[34]，建议将长麦穗鱼ST群体行为一个保护不竭单元进行优先保护，SL和LK群体行为一个合座进行不竭和保护，加强对长麦穗鱼种质资源遗传千般性的监测，永远跟踪其变化，应时地制定科学合理的保护和利用措施以保证其资源的可握续性发展。

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